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最新報(bào)道揭示M5C甲基化調(diào)控糖酵解在調(diào)控肝癌進(jìn)展中的新機(jī)制

更新時(shí)間:2025-03-15      點(diǎn)擊次數(shù):35

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RNA修飾在生命過程和疾病發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視,其中5-甲基胞嘧啶(m5C)修飾是熱門研究領(lǐng)域。

本文聚焦于m5C 甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2在肝癌中的作用,NSUN2通過M5C修飾穩(wěn)定PKM2 mRNA促進(jìn)肝癌糖酵解和進(jìn)展。

m5C修飾是指在RNA分子中,通過特定的酶將胞嘧啶(C)的第5位碳原子上加上一個(gè)甲基基團(tuán),形成5-甲基胞嘧啶。

這種修飾不會(huì)改變RNA的基本核苷酸序列,但會(huì)在不改變遺傳信息編碼的基礎(chǔ)上,賦予RNA新的化學(xué)和生物學(xué)特性。

m5C修飾主要由NSUNNOL1/NOP2/SUN)家族的甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成,涉及mRNA穩(wěn)定性與翻譯調(diào)控、tRNA 穩(wěn)定性與解碼功能、

rRNA加工與核糖體功能和非編碼RNA功能調(diào)節(jié),廣泛地參與到各種生命活動(dòng)的調(diào)控中。

研究背景:

肝癌(HCC)是常見癌癥及癌癥死亡主要原因,術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)致患者5年生存率低。RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)修飾

在多種癌癥中發(fā)揮作用,NSUN2m5C甲基轉(zhuǎn)移酶,但它在肝癌中的臨床意義、作用機(jī)制等尚不明確。

研究方法:

臨床樣本采集與分組:收集125對(duì)肝癌(HCC)及相應(yīng)癌旁組織(ANL),用于RT-qPCR、western blotIHC分析NSUN2

表達(dá)分布與患者臨床特征的相關(guān)性,并進(jìn)行mRNA m5C斑點(diǎn)印跡和m5C-RIP-seq測(cè)序。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn):主要檢測(cè)多株肝癌細(xì)胞株的及增殖、遷移和侵襲等細(xì)胞行為學(xué)改變。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn):選用5周齡雄性BALB/c裸鼠,在其雙側(cè)腋窩皮下接種HCC細(xì)胞建立皮下異種移植模型,定期測(cè)量腫瘤體積;

通過尾靜脈注射HCC細(xì)胞建立肺轉(zhuǎn)移模型,用活體成像系統(tǒng)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移過程。

其他:RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、放線菌素D實(shí)驗(yàn)、代謝測(cè)量實(shí)驗(yàn)等;

主要研究結(jié)果:

1NSUN2HCC組織中的表達(dá)上調(diào);

通過對(duì)125對(duì)HCC和癌旁組織(ANL)的研究,運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)和免疫組化(IHC)分析,結(jié)果顯示HCC組織

NSUN2的蛋白水平顯著高于ANL組織。Kaplan-Meier 生存分析,結(jié)果顯示NSUN2高表達(dá)患者的總生存期(OS)和

無復(fù)發(fā)生存期(RFS)明顯低于NSUN2低表達(dá)患者。此外,對(duì)80HCC患者的臨床病理特征與NSUN2表達(dá)進(jìn)行分析,

發(fā)現(xiàn)NSUN2高表達(dá)與腫瘤大小、微血管侵犯(MVI)、TNM分期和BCLC分期顯著相關(guān)。腫瘤越大、存在微血管侵犯、

TNM分期和BCLC分期越晚,NSUN2的表達(dá)越高。

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1. HCC組織中NSUN2高表達(dá)并與HCC不良預(yù)后有關(guān)。

2)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSUN2 對(duì)HCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響

運(yùn)用慢病毒分別在HepG2SNU387細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)NSUN2,在Hep3BHuh7細(xì)胞中穩(wěn)定沉默NSUN2。

過表達(dá)NSUN2能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移,而沉默NSUN2則抑制肝癌細(xì)胞增殖和遷移。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,

NSUN2過表達(dá)顯著促進(jìn)了裸鼠皮下瘤生長(zhǎng)并增加肝癌肺轉(zhuǎn)移,而NSUN2沉默則抑制皮下瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。

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2. NSUN2在體內(nèi)外誘導(dǎo)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

3NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾在肝癌HCC中的作用

對(duì)5對(duì)HCC和癌旁正常肝組織進(jìn)行m5C dot blotting,結(jié)果顯示HCC組織中總mRNA m5C 水平高于ANL組織;

m5C-RIP-seq分析顯示HCC和癌旁正常肝組織m5C修飾存在差異,聯(lián)合分析mRNA m5C-RIP-seq mRNA-Seq數(shù)據(jù),

發(fā)現(xiàn)HCCmRNA表達(dá)與m5C水平呈輕度正相關(guān);KEGG通路分析顯示,表達(dá)和m5C水平均上調(diào)的mRNA主要富集在

10條信號(hào)通路中,其中癌癥中的中心碳代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖

代謝等與代謝相關(guān)。

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3. NSUN2介導(dǎo)的m5C高甲基化促進(jìn)肝細(xì)胞癌的代謝轉(zhuǎn)變。

4PKM2NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾的主要靶標(biāo)

對(duì)Hep3B-NSUN2-sh2細(xì)胞及其陰性對(duì)照進(jìn)行mRNA測(cè)序,結(jié)果顯示敲低NSUN2后,236個(gè)基因上調(diào),376個(gè)基因下調(diào)。

HCC中表達(dá)上調(diào)的mRNA、m5C 水平上調(diào)的mRNA以及 Hep3B細(xì)胞中敲低NSUN2后表達(dá)下調(diào)的mRNA進(jìn)行重疊分析,

通過維恩圖篩選出11個(gè)符合標(biāo)準(zhǔn)的mRNAB3GNT3、CD7、EML2、FOXC1GDF15、LRP4、MAPT、MCTP1PKM2、

PODXL  SLC1A7)。檢測(cè)這11個(gè)mRNA40對(duì)HCC和癌旁正常肝組織中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其中7個(gè)在HCC中上調(diào)。

進(jìn)一步檢測(cè)這7個(gè)mRNA在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果顯示,在HepG2SNU387細(xì)胞中過表達(dá)NSUN2后,只有PKM2的表達(dá)上調(diào);

Hep3B Huh7細(xì)胞中沉默NSUN2后,PKM2的表達(dá)下調(diào)。此外,根據(jù)m5C-RIP-seq結(jié)果,

PKM2 mRNA上調(diào)的m5C峰位于其3′ - UTRchr15:72491753 - 72491855,hg19)。通過針對(duì)該峰的m5C-RIP-qPCR驗(yàn)證了這一結(jié)果,

進(jìn)一步表明PKM2 mRNANSUN2作用的主要靶標(biāo)。

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4. PKM2 mRNANSUN2作用的靶標(biāo)。

5NSUN2通過增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA

通過放線菌素D處理HCC細(xì)胞,并在不同時(shí)間點(diǎn)利用RT-qPCR分析PKM2 mRNA水平。結(jié)果顯示,過表達(dá)NSUN2會(huì)減緩

PKM2 mRNA的降解,而沉默NSUN2則加速其降解。m5C-RIP-qPCR發(fā)現(xiàn)SNU387細(xì)胞中過表達(dá)NSUN2后,PKM2 mRNA m5C

水平升高;在 Hep3B細(xì)胞中沉默NSUN2后,其m5C水平降低;隨后,使用針對(duì)PKM2m5C峰的引物和經(jīng)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA模板進(jìn)行亞硫酸氫鹽PCR,然后進(jìn)行Sanger測(cè)序,發(fā)現(xiàn)在chr15:72491773hg19)位點(diǎn)(C773)的信號(hào)中,

既有胞嘧啶(‘C’)又有胸腺嘧啶(‘T’),這表明該位點(diǎn)在HCC組織和細(xì)胞系中均發(fā)生了m5C 甲基化。通過計(jì)算各樣本中

C773位點(diǎn)的m5C水平,發(fā)現(xiàn)HCC組織中的m5C水平高于癌旁正常肝組織。同時(shí),SNU387細(xì)胞過表達(dá) NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平上升,

Hep3B細(xì)胞沉默NSUN2后該位點(diǎn)m5C水平則下降。最后,構(gòu)建含有野生型3′-UTRPKM2 mRNAPKM2-WT)和突變型 C773

PKM2-Mut)的質(zhì)粒進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。結(jié)果表明,過表達(dá)NSUN2可增加 PKM2-WT的熒光素酶活性,對(duì)PKM2-Mut

則無此作用;沉默NSUN2的效果則相反表明 NSUN2 對(duì)PKM2的調(diào)控作用依賴于m5C位點(diǎn)C773

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5. NSUN2通過增加m5C水平穩(wěn)定PKM2 mRNA。

6NSUN2通過上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展

通過檢測(cè)過表達(dá)和敲低NSUN2HCC細(xì)胞的葡萄糖攝取、乳酸生成、細(xì)胞外酸化率(ECAR)和糖酵解質(zhì)子外流率(glycoPER

來評(píng)估糖代謝變化。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NSUN2顯著增加了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECARglycoPER,敲低NSUN2則降低了這些指標(biāo),

表明 NSUN2 促進(jìn)HCC細(xì)胞的糖酵解。

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6. NSUN2通過上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC的糖酵解和進(jìn)展。

隨后,使用siRNA靶向PKM2,發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)PKM2四聚體、二聚體和單體的表達(dá),而過表達(dá)NSUN2可減緩這種下調(diào)作用。

敲低PKM2抑制了葡萄糖攝取、乳酸生成、ECARglycoPER,而過表達(dá)NSUN2可部分阻斷這些抑制作用,表明NSUN2 對(duì)

HCC糖酵解的促進(jìn)作用部分通過上調(diào)PKM2實(shí)現(xiàn)。最后,檢測(cè)了PKM2對(duì)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響及NSUN2的作用,發(fā)現(xiàn)

敲低PKM2抑制了HCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲,而過表達(dá)NSUN2可阻斷這種抑制作用,說明NSUN2通過上調(diào)PKM2促進(jìn)HCC細(xì)胞

的生長(zhǎng)和侵襲。

7)研究示意圖

直觀地展示從NSUN2表達(dá)上調(diào),到PKM2 mRNA穩(wěn)定、PKM2蛋白增加,再到促進(jìn)HCC糖酵解、細(xì)胞增殖和遷移的一系列過程,

為理解HCC的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù),也為后續(xù)研究潛在的治療靶點(diǎn)提供了方向。

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7. NSUN2介導(dǎo)PKM2HCC中的m5C調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖。

研究總結(jié):

肝癌中NSUN2表達(dá)上調(diào)且與預(yù)后不良相關(guān);NSUN2通過增加PKM2 mRNAm5C修飾穩(wěn)定其表達(dá),促進(jìn)糖酵解,進(jìn)而推動(dòng)肝癌進(jìn)展,

研究shou次明確PKM2NSUN2介導(dǎo)m5C修飾的靶基因,揭示NSUN2促進(jìn)肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵機(jī)制。綜合多種實(shí)驗(yàn)方法,從細(xì)胞、

動(dòng)物模型及臨床樣本quan方位驗(yàn)證,NSUN2可作肝癌預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn),為肝癌臨床診療提供新思路。

參考文獻(xiàn)

Qi, Q., Zhong, R., Huang, Y. et al. The RNA M5C methyltransferase NSUN2 promotes progression of hepatocellular 

carcinoma by enhancing PKM2-mediated glycolysis. Cell Death Dis 16, 82 (2025). 

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